CRISPR-Cas9 基因编辑

一段真实的人类基因组放在黄铜与玻璃做的梯子上，Cas9 按它的晶体坐标卡在上面。页面上的每一个分数，都是用已发表的打分表在这段序列上当场算出来的。

直接动手

章节 · 10

01三十亿里的二十个字母
02先认 PAM
03一个碱基一个碱基地配上
04两条链，两把刀
05剖开这台蛋白质机器
06它能容忍什么
07断口交给细胞
08不切断也能改
09把胎儿血红蛋白重新打开
10工作台

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01

三十亿里的二十个字母

人的一套基因组有约三十一亿个碱基对。左边是中期染色体，往右是解开的染色质纤维，再往右就是这台模型的主角：一段双螺旋，以及它上面的一个地址。

地址由两部分组成：二十个字母的靶序列，加上紧挨着它的三个字母 PAM。二十个字母的组合有一万亿种，再要求后面跟着 NGG，随机序列里碰巧撞上同一个地址的机会只有几千分之一。

这是一台模型。它按分子自己的比例做：每个碱基对升高 3.4 埃，十个半碱基对转一圈，整根梯子粗 20 埃。

3,088,286,401 bp（GRCh38 的 24 条染色体加线粒体）· 地址 20 + 3 个字母

02

先认 PAM

Cas9 不是从头到尾读一遍。它撞上 DNA，先看有没有 NGG：任意一个碱基，再两个 G。没有就松开，继续撞下一处。

两条链都算，随机序列里平均每 8 个碱基对就有一处 NGG。这段真实序列比随机的还密。梯子上亮起来的，就是这个窗口里所有能用的 PAM。

PI 结构域里几个精氨酸从大沟里读出那两个 G。读到了，Cas9 才把紧挨着 PAM 的双链撬开。

每条链 1/16，两条链合起来约每 8 bp 一处 · PAM 读的是大沟里的两个 G

03

一个碱基一个碱基地配上

双链从 PAM 这一侧被撬开。向导 RNA 的二十个字母挤进去，和靶链逐个配对；另一条链被顶出来，在外面鼓成一个环。整体叫 R 环。

配对从挨着 PAM 的那一端开始，一路往远端推。推到头，Cas9 才换成能切的构象。

梯子上这一段现在是：靶链在下，向导 RNA 在上，被顶出来的那条链绕在外面。

配对从 PAM 一侧开始 · 20 对配完，Cas9 才动刀

04

两条链，两把刀

Cas9 身上有两个核酸酶结构域。HNH 切和向导配对的那条链，RuvC 切带 PAM 的那条链。

两处断口都落在 PAM 上游第 3 个碱基对那里，所以留下的是平末端。

切开之后，Cas9 并不马上松手。断口就留在那里，等细胞自己的修复系统来。

HNH → 靶链｜ RuvC → 非靶链 · 都在 PAM 上游 3 bp · 平末端

05

剖开这台蛋白质机器

这块实体是 1368 个氨基酸的主链，按 4UN3 这套晶体坐标一点一点走出来的。

它分成两大块：识别叶（REC）抱住 RNA–DNA 双链体，核酸酶叶装着两把刀和读 PAM 的 PI 结构域。中间一根桥螺旋把两块连起来。

HNH 平时并不对着它要切的那条链。二十对配满之后它才转过去，这一步也是 Cas9 不乱切的保险之一。

REC ｜桥螺旋｜ RuvC I–III ｜ HNH ｜ PI · 结构域范围按 UniProt Q99ZW2

06

它能容忍什么

配错一个字母，不一定就不切。错在离 PAM 远的那一端，常常照切不误；错在挨着 PAM 的十来个碱基里，多半就切不动了。这一段叫种子区。

CFD 分数把每个位置、每种配错组合实测到的活性做成一张表，几处错就把几个数乘起来。这里的分数就是用那张表当场算的。

真正的脱靶要在细胞里测。右边列的是 GUIDE-seq 在细胞里找到的脱靶位点和读数；分数在旁边，由页面自己算。

CFD 分数（Doench 等 2016）· 种子区：挨着 PAM 的约 10–12 bp

07

断口交给细胞

Cas9 只负责切。剩下的是细胞自己的两条路：直接把两头接上，或者照着一份模板抄。

直接接上并不随机。断口两侧如果有两个以上相同的短序列，中间那一段常常被整段删掉；删掉的长度不是 3 的倍数，读码框就移了，基因多半报废。

还有一种常见结果是多出一个碱基：Cas9 有时留下一个碱基的突出端，补齐后就把 PAM 上游第 4 位那个字母复制了一遍。

第四个盘里是照模板抄的那条路：给细胞一段带着想要的改动的 DNA，它可以把断口按模板补回去。这条路效率低得多。

微同源删除与移码比例按 Bae 等 2014 当场算出 · +1 插入复制 PAM 上游第 4 位

08

不切断也能改

双链断口是粗活。把 Cas9 的两把刀废掉一把或两把，再在它身上挂别的酶，就能不断链地改字母。

碱基编辑器挂的是脱氨酶：在 R 环露出的那一小段单链上，把 C 改成 T，或者把 A 改成 G。不切断，不要模板。

先导编辑在 Cas9 切口酶上挂一个逆转录酶，向导 RNA 自己带着要写进去的序列，直接写进基因组。

碱基编辑：C→T（Komor 等 2016）、A→G（Gaudelli 等 2017）· 先导编辑（Anzalone 等 2019）

09

把胎儿血红蛋白重新打开

镰状细胞病和 β 地中海贫血都出在 HBB 这个基因上。第一个获批的 CRISPR 疗法没有去修它。

人在胎儿期用的是另一套血红蛋白，出生后被 BCL11A 这个开关关掉。Casgevy 把病人的造血干细胞取出来，用 Cas9 在 BCL11A 的红系增强子上切一刀，正好切在 GATA1 的结合位点里，开关失灵，胎儿血红蛋白重新打开。

药进体内的方式也不只一种：这里是取出细胞、在体外把 Cas9 蛋白和向导 RNA 做成复合物电转进去；也有用腺相关病毒和脂质纳米颗粒直接打进体内的。

英国药监局 2023 年 11 月批准，美国 FDA 2023 年 12 月批准用于镰状细胞病，2024 年 1 月批准用于输血依赖型 β 地中海贫血。

Casgevy（exa-cel）· BCL11A +58 红系增强子的 GATA1 位点 · 2023

10

工作台

挑一段真实的基因，挑一处 PAM，改向导上的字母，看分数和断口怎么变。

试一试把向导的第 2 位和第 18 位各改错一个字母，看 CFD 分数各掉多少。为什么靠近 PAM 的那一处更致命？

模型省略了什么

蛋白质画的是 1368 个氨基酸的 α 碳主链（PDB 4UN3），一个结构域一块实体；真正的蛋白质是一团原子，表面也不是这样光滑的管。晶体里没解出来的几段断开处，模型就断开。梯子上的 DNA 和 RNA 不是晶体坐标，是按 B 型 DNA 的实测参数（3.4 埃、10.5 bp 一圈、20 埃）画的理想双螺旋，只是摆在晶体里那条双链该在的位置上；真实的 R 环里，RNA–DNA 双链体是 A 型，被顶出来的那条链也不是这样规整地绕着。碱基画成长短两种棒子（嘌呤长、嘧啶短），不画原子和氢键的个数。尺度那一段的染色体和染色质纤维是示意，不是按比例缩小的同一根分子。CFD 分数衡量的是「切不切得动」，不是「在细胞里一定会被切」；真正的脱靶要在细胞里测。微同源那一套只给各种删除模式排个高低，不是真实频率。

几个常见的误解

CRISPR 不是「把基因剪掉换一个新的」：Cas9 只切一刀，改成什么样是细胞自己的修复决定的，所以「敲掉一个基因」靠的是接错，而不是精确替换。PAM 不在向导 RNA 上，而在被切的 DNA 上，是 Cas9 自己认的；没有 PAM 就切不动，这也是细菌不切自己那段 CRISPR 记录的原因之一。脱靶不等于「有几个字母不一样就会切」：位置比个数重要，靠近 PAM 的错配代价大得多。Casgevy 没有修好致病的那个突变，它改的是另一个基因上的开关。

资料来源

数据

The protein is the alpha-carbon trace of RCSB PDB entry 4UN3 (Anders, Niewoehner, Duerst & Jinek 2014), used under the PDB’s terms; the DNA and RNA on the model are idealised B-form, not the crystal’s coordinates. Sequence windows from Ensembl (GRCh38), cross-checked against the UCSC hg38 sequence API. The CFD mismatch and PAM tables are John Doench’s, as distributed with his CFD calculator and redistributed in CRISPOR (github.com/maximilianh/crisporWebsite); the microhomology arithmetic follows the source code published as Supplementary Figure 3 of Bae et al. 2014. Off-target sites and read counts from the supplementary tables of Tsai et al. 2015.

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