从头设计蛋白质

反过来的问题

蛋白质是二十种氨基酸连成的链，折起来才有用。给一条序列算它的形状，是「AlphaFold」那一页的事。设计走的是反方向：先定下要什么形状、要贴住哪一块表面，再找出能折成它的序列。

反方向的难处在于量。Baker 实验室 2016 年的综述里，开头一句就是：200 个氨基酸的蛋白质有 20²⁰⁰ 种可能的序列，自然演化只取过其中极小的一部分。

台上是一次这样的设计：白瓷是靶蛋白，黄铜丝带是为它设计的结合体，三条螺旋，停在它的沟里。两者都是本页当场算出来的，不是任何已发表的设计。

设计 = 结构预测的反问题 · 200 个氨基酸 → 20²⁰⁰ 种序列（Huang 等 2016）

第一个全新的折叠

在深度学习之前，设计靠物理：写下一个能量函数，让计算机在序列和主链之间来回优化，找能量最低的那一对。这套方法叫 Rosetta。

2003 年，Kuhlman 等人用它做出了 Top7：93 个氨基酸，一个 α/β 蛋白，论文说它的拓扑「在蛋白质数据库里没有出现过」。做出来的蛋白极稳定，98 °C 的圆二色谱和 25 °C 的几乎分不出来。

晶体结构测到 2.5 埃，和设计模型的主链原子相差 1.17 埃（摘要写作 1.2 埃）。「从头设计」这个说法从此有了分量：形状可以先在纸上定下来，再做出来。

Top7 · 93 个氨基酸 · 晶体 2.5 埃 · 和设计模型相差 1.17 埃（主链原子）· PDB 1QYS。台上这一束仍是本页自己的结合体，不是 Top7：Top7 的核心是一张 β 折叠片。

从噪声里长出主链

2023 年的 RFdiffusion 换了做法：把结构预测网络 RoseTTAFold 微调成一个去噪扩散模型。它不在原子坐标上工作，而在「残基帧」上——每个氨基酸一个 Cα 位置加一个 N–Cα–C 的朝向。训练时把数据库里的结构加噪，最多 200 步：位置加三维高斯噪声，朝向在旋转矩阵上做布朗运动。

生成时反着走：从一团随机的帧出发，一步步去噪，直到它们排成一条合理的主链。论文还加了一招「自条件化」，让每一步都能看到上一步的预测，基准测试上明显更好。在一块 NVIDIA RTX A4000 上，一个 100 个氨基酸的蛋白最快约 11 秒就能生成。

台上这条路是前向加噪的公式倒着放：每一步按 √ᾱ 留下设计、√(1−ᾱ) 留下噪声，朝向按同样的比例转回去。它是本页的插值，不是一个网络；真正的去噪每一步都要跑一遍网络。

RoseTTAFold 微调成扩散模型 · 残基帧：Cα + N–Cα–C 朝向 · 200 步 · 台上：前向公式倒放

对着靶点设计

无条件生成只给一个好看的折叠，没有用处。有用的是条件化：把靶蛋白的结构放进去，让生成的主链贴着它的某一块表面长出来。RFdiffusion 能按对称性、按靶点、按一段要保留的功能模体来生成。

贴得好不好，先看有多少氨基酸够得着对方。台上数的是 10 埃以内的 Cα 对，和由此得到的界面残基；换一张脸给它，这个数就变了。这一章把结合体抬起了一点，露出它坐的位置：描金的那一块，是靶蛋白表面离结合体的 Cα 不到 7 埃的部分。

沟最好抓：螺旋掉进去，三面都挨着。平面只能贴住一侧，凸起能挨着的最少。台上的及格线是界面至少 22 个残基、没有冲突、疏水矩的平均朝向不低于 0.6——三种脸跑下来，只有沟过得了。

条件化：对称性 · 靶点 · 功能模体 · 台上：10 埃以内的 Cα 对

剖开结合面

把靶蛋白的瓷件剖开，里面是它自己的钢丝带，和黄铜的结合体挨在一起。两者之间那一层就是结合面。

结合面上两种接触：怕水的侧链彼此贴紧，把水挤出去，这是铜色的短柱；其余是带电或带极性的一侧，可以形成氢键，这是细一些的浅色柱。

本页按 Kyte 和 Doolittle 1982 年的亲疏水标度给每个残基定性，再把 8.5 埃以内的跨链 Cα 对分成这两类。真实的结合面要看全部原子和氢键的角度，这里只看主链之间的距离。

台上：8.5 埃以内的跨链 Cα 对 · 两类：怕水的接触、可成氢键的一侧

给主链配一条序列

主链有了，还缺序列。2022 年的 ProteinMPNN 做的就是这件事：一个在主链图上传消息的神经网络，3 层编码、3 层解码，输入是 N、Cα、C、O 和一个虚拟 Cβ 之间的距离，输出是每个位置该放哪种氨基酸。

它不是从头到尾一个一个写下去，而是每次随机抽一个解码顺序。在 402 个天然单体主链上，它写出的序列和天然序列有 52.4% 相同，Rosetta 的固定主链设计是 32.9%。100 个氨基酸，它要 1.2 秒，Rosetta 要 4.3 分钟。

台上的写法是个玩具：按埋藏程度分三层（里面、边界、表面），按这一段是螺旋还是折叠片选可用的氨基酸，再看已经定好的邻居，抽一个合适的。顺序和 ProteinMPNN 一样是随机的——所以字母不是从头排到尾，而是零散地出现。

ProteinMPNN：天然序列恢复 52.4%，Rosetta 32.9%（402 个单体主链）· 随机解码顺序

先在电脑里考一遍

生成很便宜，做实验很贵。所以中间插一道考试：拿设计好的序列，反过来用 AlphaFold2 预测它的结构，再和当初设计的主链比。

RFdiffusion 的判据写得很具体：单条序列的 AF2 预测，平均预测对齐误差小于 5，主链整体在 2 埃以内，功能位点在 1 埃以内，才算「电脑里成功」。论文说，这个指标「已被发现与实验成功相关」。每个主链通常取 8 条 ProteinMPNN 序列去考。

Bennett 等人 2023 年专门量过这道考试的价值：用 AlphaFold2 或 RoseTTAFold 判断序列是否折成设计的样子、是否按设计结合靶点，把设计的成功率提高了近十倍。

台上没有结构预测，换成另一个当场算得出来的检查：每条螺旋的疏水矩——按 Eisenberg 等人 1982 年的做法，把每个残基的疏水性沿它侧链朝向加起来。铜色的箭头指的就是这条螺旋怕水的那一面，它应该指向核心或靶点。躺在沟里的那条两面都埋着，疏水的残基摊在一圈上，所以它的箭头短、方向也不明确。

AF2 回测：pAE < 5 · 主链 2 埃以内 · 位点 1 埃以内 · 每个主链 8 条序列 · 台上：疏水矩

进实验室

考过的设计要合成基因、在细菌里表达、纯化，再测它到底结不结合。RFdiffusion 的论文对五个靶点各做了一遍：流感血凝素、IL-7Rα、PD-L1、胰岛素受体、TrkA，每个靶点挑 95 个设计去做实验。

总的实验成功率是 19%，论文说这比他们先前基于 Rosetta 的方法在同样靶点上高了大约两个数量级，而且每个靶点测的设计不到 100 个，先前的研究要测几千个。亲和力不经优化就到了纳摩尔级。

最强的那个流感结合体 HA_20，解离常数 28 纳摩尔。他们用冷冻电镜解出了它和血凝素的复合物，2.9 埃的密度图；结构和设计模型相差 0.63 埃，只看结合体本身是 0.6 埃。

五个靶点 · 每个 95 个设计 · 总成功率 19% · HA_20：28 纳摩尔 · 冷冻电镜 2.9 埃 · 与设计相差 0.63 埃

已经做出来的

结合体是目前做得最顺的一类。Cao 等人 2022 年对 12 个形状和表面性质各异的靶点设计了结合体，全部小于 65 个氨基酸，经实验优化后达到纳摩尔到皮摩尔的亲和力，其中五个复合物解出了晶体结构。

抗蛇毒是一个具体的用处。Vázquez Torres 等人 2025 年用 RFdiffusion 和 ProteinMPNN 设计了结合三指毒素的蛋白：短链神经毒素的结合体解离常数 0.9 纳摩尔、熔点 78 °C，长链的 1.9 纳摩尔、熔点高于 95 °C。在致死剂量的神经毒素注射 15 分钟之后再给药，五只小鼠全部存活。

酶更难。Lauko 等人 2025 年设计了丝氨酸水解酶，摘要报告的催化效率最高到 2.2 × 10⁵ M⁻¹ s⁻¹，晶体结构和设计模型的 Cα 相差小于 1 埃，五种折叠都不同于天然的丝氨酸水解酶。

12 个靶点，均小于 65 个氨基酸（Cao 等 2022）· 抗蛇毒：0.9 纳摩尔、5 只小鼠全部存活 · 设计的水解酶：2.2 × 10⁵ M⁻¹ s⁻¹

还做不到的

成功率仍然不高。Bennett 等人在 2023 年的讨论里写：界面能量学还有很多没弄明白，「各靶点之间的成功率仍然很低（< 1%）」。Cao 等人报告过，对 TIE2 和 CD3δ，十万个设计的库里拿到的结合体不到十个。有些表面就是难：太柔软的、太带极性的。

做成的多是简单的东西。Kortemme 2024 年的综述说，眼下实验上成功的多是理想化的折叠（其中全螺旋的偏多）、对称组装体和蛋白质之间的界面。

形状比功能容易。同一篇综述说，形状的成功率视目标可以超过 10% 甚至 50%，而设计出来的功能通常只是一个起点，活性可测但很低，还要靠实验室里的优化才能用。

每一个设计最后都要做实验。ProteinMPNN 的论文把这一点说得最直接：序列设计方法的最终检验，是实验表征。还有一层考虑在实验之外：设计出来的蛋白只有被真正合成出来才可能造成危害，所以合成 DNA 的订购环节是这个领域的一道关口——这是 2024 年《Responsible AI × Biodesign》声明的原话，签名的包括 David Baker。

各靶点成功率 < 1%（Bennett 等 2023）· 十万个设计里不到十个（Cao 等 2022）· 功能比形状难

2024 年诺贝尔化学奖

2024 年诺贝尔化学奖的一半授予 David Baker，表彰「计算蛋白质设计」；另一半由 Demis Hassabis 和 John Jumper 分享，表彰「蛋白质结构预测」。

新闻稿里写：蛋白质一般由 20 种不同的氨基酸组成，可以说是生命的积木；2003 年，David Baker 用这些积木成功设计出了一个和已有的任何蛋白质都不同的新蛋白。

两件事是一件事的两个方向。读懂了序列和形状的关系，就既能从序列算出形状，也能从形状写出序列。

2024 年诺贝尔化学奖 · 一半：计算蛋白质设计 · 另一半：蛋白质结构预测

拆开来看

把结合体拆开：三条螺旋和两段环。指针停在哪一段，哪一段就被托出来并写上名字。